Application of PCR-RFLP for Species Identification of Symbiont Insects of Honey Bees
DOI:
https://doi.org/10.7868/S3034519726020157Keywords:
PCR-RFLP, bee symbionts, molecular species identification, COI gene, Apis mellifera, restriction enzymesAbstract
Monitoring the species composition of arthropod symbionts in honeybee hives is important and necessary for the health of bee colonies. However, it is difficult to use morphological methods when working with degraded material, body fragments, or preimaginal stages. In this study, a PCR-RFLP method was developed and validated for the primary molecular identification of several species of insect symbionts and pests of honeybees (Vespula germanica, V. vulgaris, Galleria mellonella, Tribolium madens, Forficula tomis) and their differentiation from the honeybee (Apis mellifera). Based on bioinformatics analysis of the consensus sequences of the COI gene, in silico restriction was performed with more than 50 restriction endonucleases, which resulted in the selection of only two (AclWI and BstX2I). Unique, non-overlapping restriction profiles were obtained for each of the six species. Sanger sequencing was performed to validate the developed method; the obtained restriction profiles for each sample coincided with the sequencing results. The method has proven effective for identifying insects at different stages of development and may be a rapid and cost-effective alternative to sequencing for routine monitoring of bee symbionts. This could potentially be useful for developing specific methods for controlling the population of bee hive pests.
References
1. Бакалова М.В., Бакалов В.С. Динамика численности доминантных видов насекомых-симбионтов в бортях медоносных пчел заповедника «Шульган-Таш» // Материалы докладов пятой Всерос. науч.-практ. Конф. «Человек и природа: взаимодействие на особо охраняемых природных территориях». Новокузнецк-Таштагол, 2023. C. 67-73.
2. Ваулин О.В., Захаров И.К. Маркерные последовательности ДНК для идентификации известных и выявления новых видов растений и животных // Письма в Вавиловский журнал селекции и генетики. 2021. №3(7). С. 119-123. https://doi.org/10.18699/LettersVJ2021-7-14
3. Воронова Н.В., Воробьева М.М., Жоров Д.Г., Буга С.В. Применимость метода ПЦР-ПДРФ анализа баркодингрегиона COI для идентификации инвазивных видов насекомых в фауне Беларуси (на примере тлей рода Aphis L.) // Молекулярная и прикладная генетика. 2016. Т. 21. С. 64-70.
4. Медведева С.О., Черепанова О.Е., Филиппов Е.Г., Копориков А.Р. Использование ITS маркеров для определения видовой принадлежности берез секции Apterocaryon // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии. 2023. №2(10). С. 187-190. https://doi.org/10.14258/pbssm.2023123
5. Столбова В.В. Распространение складчатокрылых ос (Hymenoptera: Vespidae) в ульях Apis mellifera на пасеках Тюменской области // Экология: факты, гипотезы, модели: материалы конф. молодых ученых. Институт экологии растений и животных УрО РАН; редкол.: А.Н. Созонтов и др. Екатеринбург: Альфа Принт, 2024. С. 210–212. https://doi.org/10.5281/zenodo.14748373
6. Фадеев Р.Р., Тимофеев С., Долгих В.И др. Молекулярные стратегии борьбы с микроспоридиями Nosema bombycis и Vairimorpha ceranae, внутриклеточными паразитами шелковичного червя и медоносной пчелы // VII съезд паразитологического общества: итоги и актуальные задачи. 2023. С. 101-103.
7. Черник М.И., Прищепчик О.В., Гуринович О.Л., Иващенко Л.О. Жук-чернотелка Tribolium madens – переносчик возбудителя американского гнильца медоносных пчел // Экология и животный мир. 2025. С. 8-12.
8. Archana M., Placid E.D., Jalali S.K. et al. DNA barcoding of commonly prevalent Culicoides midges in South India // The Indian Journal of Animal Sciences. 2015. No. 1(85). P. 37-39.
9. Bosco D., Loria A., Sartor C., Cenis J. PCR-RFLP Identification of Bemisia tabaci biotypes in the Mediterranean Basin // Phytoparasitica. 2006. No. 34. P. 243-251. https://doi.org/10.1007/BF02980951
10. Buteler M., Yossen M.B., Alma A.M., Lozada M. Interaction between Vespula germanica and Apis mellifera in Patagonia Argentina apiaries // Apidologie. 2021. No. 52. P. 848–859. https://doi.org/10.1007/s13592-021-00871-9
11. Gavrilova D., Zenkova A., Dubovskiy I. et al. Antisense DNA acaricide targeting pre-rRNA of two-spotted spider mite Tetranychus urticae as efficacy-enhancing agent of fungus Metarhizium robertsii // Journal of Invertebrate Pathology. 2025. Vol. 211. https:/doi.org/10.1101/2024.10.29.620568
12. Hebert P.D., Cywinska A., Ball S.L., de Waard J.R. Biological identifications through DNA barcodes // Proc Biol Sci. 2003. P. 313-321. https://doi: 10.1098/rspb.2002.2218
13. Hosni, E.M., Al-Khalaf A.A., Nasser M.G. et al. Modeling the potential global distribution of honeybee pest, Galleria mellonella under changing climate // Insects. 2022. No. 13(5). P. 1–12. https://doi.org/10.3390/insects13050484
14. Lannutti L., Gonzales F.N., Dus Santos M.J. et al. Molecular detection and differentiation of arthropod, fungal, protozoan, bacterial and viral pathogens of honeybees // Veterinary Sciences. 2022. No. 9(5). P. 1-52. https://doi.org/10.3390/vetsci9050221
15. Levit A.L., Singh R., Cox-Foster D.L. et al. Cross-species transmission of honey bee viruses in associated arthropods // Virus Research. 2013. No. 176(1-2). P. 232–240. http://dx.doi.org/10.1016/j.virusres.2013.06.013
16. Mifkova T., Skoupa K., Knoll A. Barcoding analysis for identification of insect species on decaying remains // Acta fytotechn zootechn. 2023. No. 4(26). P. 347-353. https:/doi.org/10.15414/afz.2023.26.04.347-353
17. Pramual P., Wongpakam K., Adler P.H. Cryptic biodiversity and phylogenetic relationships revealed by DNA barcoding of Oriental black flies in the subgenus Gomphostilbia (Diptera: Simuliidae) // Genome. 2011. No. 54(1). P.1-9. https:/doi.org/10.1139/G10-100
18. Sopaladawan P.N. Genetic diversity and demographic history of wax moths, Galleria mellonella Linnaeus, 1758 and Achroia grisella Fabricius, 1794 (Lepidoptera: Pyralidae) // Trends in Sciences. 2024. No. 22(1). P. 1-11. https://doi.org/10.48048/tis.2025.8946
19. Stolbova V.V., Garbaly V.R., Krestonoshina K.S., Zinatullina Z.Y. Molecular Characterization of the Forficula tomis based on the Cytochrome C Oxidase I Gene // World Veterinary Journal. 2025. No. 15(3). P. 638-646 https:/doi.org/10.54203/scil.2025.wvj64
20. Stolbova V.V., Stolbov V.A. Inquiline insects of the honey bee Apis mellifera in Western Siberia (Hymenoptera, Apidae) // Journal of Hymenoptera Research. 2023. No. 96. P. 555–568. https://doi.org/10.3897/jhr.96.104720
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-00065 “Молекулярная видовая диагностика членистоногих-симбионтов медоносных пчел”, https://rscf.ru/project/24-26-00065/
