ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ?-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Аннотация

Ферментные препараты – источники ?-галактозидазы, находят широкое применение в молочной промышленности. Однако отсутствуют стандартизированные методы определения их активности. Существующие методы различаются по виду используемого субстрата, условий проведения анализа  и способа определения продуктов гидролиза. Цель работы – исследование процесса биокаталитической конверсии молочного сахара и экспериментальное обоснование метода анализа продуктов гидролиза, обеспечивающего получение достоверных результатов определения ?-галактозидазной активности. Установлено, что из химических методов глюкозооксидазный проявил более высокую чувствительность по отношению к низким концентрациям продукта гидролиза – глюкозе, образующейся в процессе конверсии лактозы. Результаты апробации показали, что массовая концентрация глюкозы, образуемой в процессе гидролиза лактозы, тестируемой ВЭЖХ, соответствовала полученным данным с использованием глюкозооксидазного метода. Установлен оптимальный диапазон, в котором наблюдалась прямо пропорциональная зависимость уровня нарастания концентрации глюкозы в реакционной смеси от длительности процесса и фермента: время гидролиза – от 10 до 20 мин., концентрация  образующейся   глюкозы - от 20 мкг до 40 мкг при массе фермента 25,0·10^-6 г, и от 40 мкг до 80 мкг при массе - 5,0·10^-5 г.  Оптическая плотность реакционной смеси находилась в пределах 0,045-0,300. Результаты исследований по определению активности ферментных препаратов подтвердили подученные экспериментальные данные и позволили выбрать оптимальные параметры и условия проведения анализа для введения их в методику определения ?-галактозидазной активности фотоколориметрическим методом с применением глюкозооксидазного реактива: время инактивации фермента (для контроля) – 10 мин.  в кипящей водяной бане, субстрат – 2%-й раствор лактозы, рН  субстрата – 6,0, время гидролиза 15 мин. при 30 °С.